青光眼中Cochlin和Cochlin结合蛋白的作用

Cochlin是一种分泌的53kDa糖蛋白，是基因产物整联蛋白超家族的成员（Bhattacharya，2006年）。尽管其功能很大程度上未知，但其一级氨基酸结构包含一对Von Willebrand因子域（即糖蛋白结合域），这可以解释其在细胞外基质中的存在（图1）。Cochlin由多种不同的细胞类型表达和分泌，包括内耳细胞和眼前房的睫状上皮细胞。

在眼前房中，睫状上皮细胞产生眼内液（IOF），该液在维持眼部整体形状方面起直接作用，而在维持视神经健康方面起间接作用。由睫状上皮细胞产生后，IOF流经前房的各个区域，最终通过与Schlemm管相邻的小梁网离开该房，并在此处被毛细血管床吸收。需要仔细平衡IOF产生和再吸收的速率，以维持适当的眼内压（IOP）。从这个意义上讲，小梁网通过控制流体的静水阻力而在保持这种平衡方面起着关键作用-小梁网引起的过多阻力会导致眼内IOP的危险积聚，继而，导致视神经病理，最终导致失明。用于描述过度眼压的病理累积的医学术语是青光眼，在大多数情况下，被认为是通过小梁网的流动阻力失调的直接结果（Sommer，1989；Lütgen-Drecoll，2000）。

2005年，Sanjoy Bhattacharya博士与Aves Labs接触，目的是生产一套定制抗体，使他的团队能够研究Cochlin在调节IOP和促进青光眼中的可能作用。以前已经证明Cochlin参与了各种不相关的遗传疾病，包括那些涉及凝血的疾病（Cochlin从中得名-凝血因子C同源性）和一种称为DFNA9的特定形式的迟发性耳聋（Robertson等。 （1997年）。有趣的是，这些DFNA9患者不仅表现为进行性高频听力损失，还表现为青光眼。

从Bhattacharya博士发送给我们的人Cochlin氨基酸序列中，我们使用我们专有的ImmunogenicityAlgorithm®寻找合适的肽序列。从肽候选物列表中，Bhattacharya博士选择了三种制备抗肽抗体的方法：＃1来自LCCL域和第一个von Willebrandt因子A域之间的区域，＃2和＃3来自第二个von Willebrandt因子A域。域（图1）。选择这些肽的部分原因是因为它们与Cochlin中两个已知的N-糖基化位点（天冬酰胺100和221）相距较远，这肯定会消除针对非糖基化肽的抗体识别天然蛋白的能力。一般来说，

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图1.人Cochlin前体的一级氨基酸结构（改编自Piciani等人，2007）

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在与Bhattacharya博士协商后，我们向这些序列的N端添加了一个半胱氨酸和一个合成的间隔氨基酸，并合成了该肽。在7周的时间内，将这些肽的匙孔血蓝蛋白（KLH）缀合物注入六只产蛋母鸡（每种肽为一对母鸡）的胸肌中，然后在3周内收集卵。第四次注射。我们使用专有方法从每对母鸡的12个鸡蛋中纯化了几克IgY，并从这种IgY制备物中进一步纯化了数十毫克亲和纯化的抗体。由于在该项目的鸡蛋收集阶段母鸡没有受到伤害，因此我们能够进行额外的注射并收集更多的鸡蛋。

有了这些亲和纯化的抗体，Bhattacharya博士的研究小组开始研究Cochlin与青光眼之间的关系。图2显示了在两个年龄和性别匹配的人类供体中小梁网的小梁网。面板A是非青光眼的36岁男性供体，而面板B示出了患有青光眼的34岁男性供体。注意青光眼供体的小梁网中存在cochlin免疫反应性，而对照供体则不存在（Picciani等，2007；另见Bhattacharya等，2005； Wang等，2015）。从其他供体制备的小梁网匀浆的Western印迹证实，图2中所示的免疫反应性对应于Cochlin蛋白（图3）（Picciani等，2007）。

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图2.青光眼小梁网中的Cochlin免疫反应性（上图和下图b），而不是对照供体（上图和下图a）。注意下图b（来自青光眼的供体）中存在cochlin免疫反应性（红色染色），而下图a（非非青光眼的供体中）不存在这种免疫反应性是由亲和纯化的cochlin＃3抗体产生的。所有面板上的星号都显示了Schlemm运河的位置作为解剖参考点（来自Picciani等，2007）。

图3. Western印迹显示在来自青光眼而非非青光眼供体的小梁网匀浆中cochlin免疫反应性的存在。泳道a是胶原II的负载对照（使用兔抗胶原II型抗体）；d道使用在Aves Labs制备的亲和纯化的抗Cochlin肽抗体（cochlin＃1）。请注意，来自青光眼供体但非青光眼供体的小梁网中正确分子量（53 kDa）的cochlin免疫反应性存在。（摘自Picciani等，2007）

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然后，Bhattacharya博士的团队使用青光眼的小鼠模型开始了一系列研究，利用慢病毒载体中插入的cochlin cDNA引起了cochlin的过度表达。DBA小鼠通常不会随年龄增长而出现IOP或青光眼。但是，当将含有组成型启动子控制下的Cochlin基因的慢病毒载体眼内注射到DBA小鼠中时，其IOP在几天之内增加了约2倍，并保持了数周的升高（Goel等，2012）（参见以及图4A）。使用Aves Labs抗体的免疫组织化学研究证实小梁网中存在Cochlin免疫反应性（Goel等人，2012）。未注射的小鼠或注射有阴性对照基因人血清白蛋白的小鼠的IOP均无明显变化。

为了测试Cochlin的低表达是否会导致IOP降低，给小鼠注射了另一种慢病毒，引起短发夹环反义RNA（shRNA，也称为“沉默RNA”）的表达。在这些研究中，注射Cochlin shRNA导致IOP在10天内下降，并且这种下降持续了几个月（Goel等，2012）（另请参见图4B）。

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图4.小鼠中Cochlin-GFP融合蛋白的过表达增加了IOP，而Cochlin沉默RNA的表达降低了IOP。

在图A中，向小鼠眼内注射含有Cochlin-GFP构建体的慢病毒，以引起Cochlin融合蛋白（空心菱形）或人血清白蛋白（HSA）融合蛋白（实心圆）的过表达或假注射实心三角形，然后在各个时间段后测量IOP。注意，早在注射后5天，注射cochlin融合蛋白导致IOP显着增加。

在图B中，给小鼠眼内注射含有短发夹沉默RNA（ShRNA）的慢病毒（空心菱形），或假注射（实心三角形），并在不同时间段后测量其IOP。请注意，与假注射小鼠相比，注射沉默RNA导致IOP明显降低。

（改编自Goel等，2012）

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在最近的工作中，Bhattacharya博士研究了分子机制，通过这些分子机制，cochlin和各种cochlin结合蛋白（例如TREK-1和Annexin A2）可能会增加小梁网内的流动阻力（Goel等人，2011年; Carreon等人。 ，2017）。这些研究说明了IOF流经小梁网的复杂机制，以及失调如何导致青光眼及其后果，例如失明。

参考文献

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• Bhattacharya，SK，Rockwood，EJ，Smith，SD，Bonilha，VL，Crabb，JS，Kuckey，RW，Robertson，NG，Peachey，NS，Morton，CC，Crabb，JW（2005）。蛋白质组学揭示了与青光眼小梁网相关的Cochlin沉积物。J.Biol。化学 280：6080-6084。
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